Akcja gry toczy się w roku 1476, czyli w epoce Renesansu. Gracz kieruje postacią Ezio Auditore da Firenze - młodego szlachcica mieszkającego we Włoszech. Ezio pragnie zemsty za zdradę jego rodziny i w tym celu postanawia nauczyć się zabijania. Assassin's Creed II posiada główny wątek fabuły oraz misje poboczne, które podzielono na 16 rodzajów. Podczas zabawy użytkownik odwiedza m.in. Sycylię, Florencję, Wenecję czy Toskanię. Można spotkać również postaci historyczne, takie jak Machiavelli czy Lorenzo de Medici. Rozgrywka głównie polega na skradaniu się, wtapianiu w otoczenie oraz atakowaniu. Dodatkowo postać kierowana przez gracza umie pływać, atakować przeciwnika z dachu i wyrwać mu broń z ręki. Do dyspozycji rozgrywającego oddano m.in. maszynę latającą autorstwa Leonarda Da Vinci (który staje się przyjacielem Ezio) oraz szereg broni (np. miecze, topory czy włócznie). Za znalezienie ukrytej flagi lub statuetki użytkownik otrzymuje bonusy. W razie odniesienia obrażeń podczas walki można udać się do lekarza. Istnieje również możliwość przekupienia świadków morderstwa i wtapiania się w tłum. W grze występują również trzy frakcje, z którymi Ezio może współpracować: najemnicy, złodzieje i kurtyzany.
